Elle avait 14 frères et sœurs parmi lesquels Anne et Constance de Pologne (épouses successives du roi Sigismond III Vasa) et l'empereur Ferdinand II. Elle et ses frères et sœurs ont une vie roturière, elle avait l'habitude de se lever de bonne heure, entendait la messe et allait prier.
Personnalité
Elle fut une grande protectrice des arts, exerça une influence déterminante dans la vie du palais royal ; d'une profonde religiosité, elle disait entendre des voix, des visions en se rendant dans la chapelle des chambres et était toujours entourée de religieuses et de prêtres.
La reine chercha à contrer l'emprise que le duc de Lerme, favori du roi, avait sur les affaires gouvernementales, ce qui lui fit tout d'abord perdre de l'influence à la cour, mais Marguerite réussit par la suite à faire ouvrir une enquête qui dévoila un réseau de corruption impliquant le duc et ses proches, grâce à l'aide de son confesseur Luis de Aliaga(es). Ce n'est qu'après la mort de la reine que la lumière fut faite sur la corruption des grands, plusieurs d'entre eux furent condamnés, parmi lesquels Rodrigo Calderón. Le duc de Lerme parvint à être acquitté, mais dut se retirer de la vie publique en 1618. La reine ne put assister à sa chute.
Mort
Elle meurt en 1611 à l'âge de 26 ans après avoir mis au monde son huitième enfant. Elle est enterrée dans l'Escurial dans le panthéon des rois avec son époux.
Mariage
Elle épousa le Philippe III d'Espagne, qui était à la fois son cousin issu de germain et son petit-cousin.
Elle donna le jour à huit enfants :
Anne (1601-1666), reine de France, mariée à Louis XIII, roi de France, régente de France et mère de Louis XIV ;
Les générations sont numérotées dans l'ordre de la descendance depuis les premiers archiducs. Au sein de chaque génération, l'ordre est strictement chronologique et défini par la date de naissance.