Cas3

Helikase terkait CRISPR, famili Cas3
Cas3 Thermobifida fusca PDB: 4QQW​
Identifiers
OrganismeThermobifida fusca
SimbolCas3
PDB4QQW
UniProtQ47PJ0
Domain C-terminal Cas3
Identifikasi
Simbolcas3
PfamPF18395
InterProIPR041372
Untuk versi ketiga dari Central Authentication Service (CASv3), lihat Central Authentication Service.

Cas3 adalah enzim translokase/helikase DNA untai tunggal (ssDNA) yang bergantung pada ATP yang mendegradasi DNA sebagai bagian dari kekebalan berbasis CRISPR.[1]

Cas3 adalah protein "tanda tangan" dari sistem CRISPR kelas 1 dan berfungsi dalam kompleks yang dikenal sebagai CASCADE, bersama dengan gen cas lainnya dan RNA penarget untuk mendegradasi DNA virus.[1]

Pada April 2019, peneliti Universitas Cornell Ailong Ke menerbitkan makalah dalam jurnal Molecular Cell yang mendeskripsikan sistem CRISPR penyunting gen baru, CRISPR-Cas3, yang dapat menghapus potongan panjang DNA secara efisien dari situs target dalam genom manusia. Kemampuan ini lebih unggul dibandingkan dengan yang dicapai dengan sistem CRISPR-Cas9 yang lebih umum.[2]

CONAN, sebuah pendekatan diagnostik berbasis CRISPR, dikembangkan dengan menggunakan Cas3.[3]

Struktur dan fungsi

Cas3 dari termofil Thermobifida fusca adalah protein empat domain dengan domain nuklease tipe-HD di N-terminal, diikuti oleh dua domain mirip RecA yang membentuk motif helikase superfamili 2, kemudian domain penaut khusus Cas3 dan domain C-terminal. DNA untai tunggal dilewatkan 3′-ke-5′ dari domain helikase ke domain nuklease tempat DNA tersebut dihidrolisis.[4]

Aktivitas nuklease

Cas3 terdiri dari domain HD-nuklease yang menyatu dengan dua domain mirip RecA. Domain-domain ini menjalankan translokasi dan degradasi ssDNA yang bergantung pada ATP. Sebuah heliks terpapar dan residu tirosin/triptofan yang terletak di domain RecA-HD sangat penting untuk fungsionalitas mekanisme ini. Selain itu, fungsi nuklease didukung oleh ion logam seperti besi, mangan, dan kalsium, yang bekerja untuk mengatur interaksi antara Cas3 dan Cascade.[5]

Validasi urutan DNA target oleh Cascade sangat penting untuk efektivitas Cas3 sebagai nuklease dalam sistem CRISPR. Proses ini dicapai melalui identifikasi Protospacer Adjacent Motif pada situs target, diikuti oleh pembentukan R-loop Cascade yang mengunci DNA target. Struktur ini memungkinkan Cas3 untuk memuat dirinya ke ssDNA dan berinteraksi dengan subunit Cse1 dari saluran Cascade. Secara khusus, Cas3 berlabuh ke alfa heliks H1 dari Cse1, yang memicu degradasi DNA target oleh aktivitas HD-nuklease Cas3. Degradasi ini dicapai melalui penorehan (nicking) DNA oleh HD-nuklease di dalam R-loop, yang menggantikan ssDNA. Domain RecA memberi tenaga pada translokasi Cas3 yang bergantung pada ATP di sepanjang ssDNA.[5]

Aktivitas translokase dan helikase

Setelah Cas3 dimuat ke ssDNA dan melakukan translokasi yang bergantung pada ATP, aktivitas helikase terjadi. Helikase Cas3 dapat memisahkan untai dupleks DNA dan mungkin dapat menggantikan protein DNA lain selama translokasi. Proses ini terjadi ketika Cas3 bertranslokasi menjauh dari Cascade sementara Cascade tetap terikat pada situs target.[5]

C-terminal dari Cas3 membawa motif tanda tangan dari helikase superfamili 2 dari subgrup DExD/H. Domain serupa telah terbukti merekrut protein dan kompleks mitra, dan domain terminal Cas3 mungkin memiliki fungsi yang sama. Sembilan domain terkonservasi Q, I, Ia, Ib, dan II–VI telah diidentifikasi dalam helikase tipe DExD/H superfamili 2. Domain-domain ini memungkinkan helikase yang bergantung pada ATP untuk bertranslokasi atau merombak asam nukleat. Cas3 menunjukkan aktivitas ATPase yang bergantung pada ssDNA, yang membutuhkan ion Mg2+ untuk fungsionalitasnya. Selain itu, aktivitas penguraian heliks (unwinding) dari Cas3 juga bergantung pada konsentrasi protein dan keberadaan ATP.[6]

Implikasi fungsional

Penyuntingan gen

Perusakan DNA yang dikatalisis oleh Cas3 memainkan peran penting dalam reaksi penyuntingan genetik. Cas3, ketika dikomplekskan dengan Cascade, dapat berfungsi dalam penyisipan dan penghapusan genetik yang ditargetkan ketika dikirimkan ke dalam sel sebagai protein dengan sinyal lokalisasi nuklir. Karena persyaratan bagi Cascade untuk terkunci pada target DNA sebelum aktivasi Cas3, terdapat tingkat efek di luar target (off-target) yang rendah. Cas3 telah terbukti memfasilitasi penghapusan genetik wilayah besar, hingga 200kb, ketika diekspresikan dalam sel HEK293 manusia. Selain itu, kemampuan peloncatan ekson dari Cas3 menunjukkan potensi untuk perawatan terapi genetik di masa depan untuk kondisi seperti distrofi otot.[5]

Penggambaran Cas3 tipe I-C tidak aktif vs aktif dan situs aktif Cas3

Sebagai perbandingan dengan kemampuan penyuntingan gen skala besar dari Cas3, enzim CRISPR-Cas9 dan Cas12a yang terkemuka saat ini terbatas dalam intervensinya. Enzim-enzim ini menghasilkan penghapusan kecil dan mutasi titik. Di sisi lain, sistem Cascade-Cas3 dapat digunakan untuk penghapusan yang jauh lebih besar dengan efisiensi tinggi. Hal ini dicapai melalui kemampuan unik Cas3 yang memungkinkan penghapusan dua arah dari satu situs potong. Selain itu, kemampuan dua arah memungkinkan penghapusan yang cepat dibandingkan dengan enzim lainnya.[7]

Kekebalan adaptif yang dimediasi CRISPR

Kekebalan adaptif yang dimediasi CRISPR memerlukan tiga tahap: akuisisi urutan, biogenesis RNA CRISPR, dan interferensi target. Kompleks pengawasan yang dipandu RNA CRISPR membantu proses ini dalam menargetkan non-diri secara efisien melalui pengenalan motif pendek. Sistem tipe IE, yang menggunakan Cas3, menggunakan Cascade sebagai kompleks pengawasan dalam proses ini. Melalui pengikatan dan pembengkokan Cascade ke DNA target, R-loop terbentuk, dan Cas3 direkrut ke dalam kompleks.[8]

ATP meningkatkan perekrutan Cas3 ke R-loop, dan pengikatan meningkatkan aktivitas ATPase Cas3. Domain HD-nuklease dari Cas3 menoreh dan mendegradasi DNA target secara searah dari untai yang tergeser ke arah 3' ke 5'. Degradasi yang dimediasi Cas3 juga dapat merekrut Cas1 dan Cas2, protein yang terlibat dalam proses integrasi spacer, sebagai persiapan untuk kekebalan asing di masa depan.[8]

Referensi

  1. ^ a b He L, St John James M, Radovcic M, Ivancic-Bace I, Bolt EL (February 2020). "Cas3 Protein-A Review of a Multi-Tasking Machine". Genes. 11 (2): 208. doi:10.3390/genes11020208. PMC 7074321. PMID 32085454.
  2. ^ "CRISPR-Cas3 innovation holds promise for disease cures, advancing science". Cornell Chronicle (dalam bahasa Inggris). Diakses tanggal 2020-09-07.
  3. ^ Yoshimi K, Takeshita K, Yamayoshi S, Shibumura S, Yamauchi Y, Yamamoto M, et al. (February 2022). "CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and influenza virus". iScience. 25 (2) 103830. Bibcode:2022iSci...25j3830Y. doi:10.1016/j.isci.2022.103830. ISSN 2589-0042. PMC 8801231. PMID 35128347.
  4. ^ Huo Y, Nam KH, Ding F, Lee H, Wu L, Xiao Y, et al. (2014). "Structures of CRISPR Cas3 offer mechanistic insights into Cascade-activated DNA unwinding and degradation". Nature Structural & Molecular Biology (dalam bahasa Inggris). 21 (9): 771–777. doi:10.1038/nsmb.2875. ISSN 1545-9985. PMC 4156918. PMID 25132177.
  5. ^ a b c d He L, James M, Radovcic M, Ivancic-Bace I, Bolt EL (2020-02-18). "Cas3 Protein—A Review of a Multi-Tasking Machine". Genes (dalam bahasa Inggris). 11 (2): 208. doi:10.3390/genes11020208. ISSN 2073-4425. PMC 7074321. PMID 32085454.
  6. ^ Sinkunas T, Gasiunas G, Fremaux C, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V (2011-04-06). "Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system". The EMBO Journal. 30 (7): 1335–1342. doi:10.1038/emboj.2011.41. ISSN 0261-4189. PMC 3094125. PMID 21343909.
  7. ^ Csorgo B, Leon LM, Chau-Ly IJ, Vasquez-Rifo A, Berry JD, Mahendra C, et al. (2020-10-19). "A compact Cascade–Cas3 system for targeted genome engineering". Nature Methods (dalam bahasa Inggris). 17 (12): 1183–1190. doi:10.1038/s41592-020-00980-w. ISSN 1548-7105. PMC 7611934. PMID 33077967.
  8. ^ a b Jackson RN, Lavin M, Carter J, Wiedenheft B (2014-02-01). "Fitting CRISPR-associated Cas3 into the Helicase Family Tree". Current Opinion in Structural Biology. Folding and binding / Nucleic acids and their protein complexes. 24: 106–114. doi:10.1016/j.sbi.2014.01.001. ISSN 0959-440X. PMC 3984625. PMID 24480304.
Ikon rintisan

Artikel bertopik enzim ini adalah sebuah rintisan. Anda dapat membantu Wikipedia dengan mengembangkannya.

Content Disclaimer

Informasi ini disarikan dari Wikipedia dan disajikan kembali untuk tujuan edukasi. Konten tersedia di bawah lisensi CC BY-SA 3.0. Kami tidak bertanggung jawab atas ketidakakuratan data yang bersumber dari kontribusi publik tersebut.

  1. The information displayed on this website is sourced in part or in whole from Wikipedia and has been adapted for the purpose of restating it. We strive to provide accurate and relevant information, however:
  2. There is no guarantee of absolute accuracy. Wikipedia is an open, collaborative project that can be edited by anyone, so information is subject to change.
  3. It is not intended to constitute professional advice. The content displayed is for informational and educational purposes only. For important decisions (e.g., medical, legal, or financial), please consult a professional.
  4. Content copyright. Wikipedia is licensed under the Creative Commons Attribution-ShareAlike License (CC BY-SA). This means that content may be reused with appropriate attribution and shared under a similar license.
  5. Responsible use. Any risk arising from the use of information from this website is entirely the responsibility of the user.